实验40 植物组织中过氧化氢含量及过氧化氢酶活性测定 植物在逆境下或衰老时,由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸,蛋白质等生物大分子,并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此,植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量,利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性。一、过氧化氢含量的测定【原理】H2O2与硫酸钛(或氯化钛)生成过氧化物—钛复合物黄色沉淀,可被H2SO4溶解后,在415nm波长下比色测定。在一定范围内,其颜色深浅与H2O2浓度呈线性关系。【仪器和用具】研钵;移液管0.2ml×2支,5ml×1支;容量瓶10ml×7个,离心管5ml×8支;离心机;分光光度计。【试剂】100μmol/L H2O2丙酮试剂:取30%分析纯H2O2 57μl,溶于100ml,再稀释100倍;2mol/L硫酸;5%(W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水。 【方法】 1.制作标准曲线浓度标准曲线配置表试剂(ml)离 心 管 号1234567100μmol/L H2O200.10.20.40.60.81.04℃下预冷丙酮1.00.90.80.60.40.205%硫酸钛0.10.10.10.10.10.10.1浓氨水0.20.20.20.20.20.20.2 3000r/min 离心10min,弃去上清夜,留沉淀2mol 硫酸5.05.05.05.05.05.05.0 待沉淀完全溶解后,将其小心转入10ml容量瓶中,并用蒸馏水少量多次冲洗离心管,将洗涤液合并后定容至10ml刻度,415nm波长下比色。 2.样品提取和测定:(1)称取新鲜植物组织2~5g(视H2O2含量多少而定),按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后,转入离心管3000 r/min下离心10min,弃去残渣,上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml,按表35-1加入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后3000rpm/min离心10min,弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3~5次,直到去除植物色素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解后,与标准曲线同样的方法定容并比色。 3.结果计算: 植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=式中 C—标准曲线浓度(μmol); Vt—样品提取液总体积(ml); V1—测定时用样品提取液体积(ml); FW—植物组织鲜重(g)。二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法 【原理】过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH-) R(Fe+3OH-)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2 据此,可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 【仪器和用具】研钵;三角瓶50ml×4;酸式滴定管(10ml);恒温水浴;容量瓶25ml×1。 【试剂】10% H2SO4;0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8;0.1mol/L高锰酸钾标准液:称取KMnO4(AR)3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml,用0.1mol/L草酸溶液标定;0.1mol/L H2O2:市售30% H2O2大约等于17.6mol/L,取30% H2O2溶液5.68ml,稀释至1000ml,用标准0.1mol/ KMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定;0.1mol/L草酸:称取优级纯H2C2O4 ·2H2O 12.607g,用蒸馏水溶解后,定容至1L。 【方法】 1.酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25ml容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转入容量瓶中,用同一缓冲液定容,4000rpm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 2.取50ml三角瓶4个(两个测定两个对照),测定瓶中加入酶液2.5ml,对照瓶中加入煮死酶液2.5ml,再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2,同时计时,于30℃恒温水浴中保温10min,立即加入10% H2SO4 2.5ml。3.用0.1mol/L KMnO4标准溶液滴定H2O2,至出现粉红色(在30min内不消失)为终点。 4.结果计算: 酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示: 酶活(mgH2O2/gFW·min)=式中 A—对照KMnO4滴定毫升数; B—酶反应后KMnO4滴定毫升数; VT—酶液总量(ml); V1—反应所用酶液量(ml); W—样品鲜重(g); 1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。 【注意】 所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。三、过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法【原理】H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。【仪器与用具】 紫外分光光度计;离心机;研钵;250ml容量瓶1个;0.5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支;10ml试管3支;恒温水浴;【试剂】0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮);0.1mol/L H2O2(用0.1mol/L高锰酸钾标定)。 【方法】 1.酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中,加入2~3ml 4℃下预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。2.测定:取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表40-2顺序加入试剂。表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表管 号S1S2S3粗酶液(ml)0.00.20.2pH7.8磷酸(ml)1.51.51.5蒸馏水(ml)1.01.01.0 25℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比色杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性。 3.结果计算: 以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位(u)。 过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=式中 A240 = AS0- AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值; AS1, AS2—样品管吸光值; Vt—粗酶提取液总体积(ml); V1—测定用粗酶液体积(ml); FW—样品鲜重(g); 0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u); t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。 【注意事项】 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。